Protocolo QIAGEN

1. Pesar 100 mg de la muestra.
2. Añadirle 400 µl del tampón AP1, 4 µl de RNasa A (100 mg/ml) y 20 µl de proteinasa K. Mezclar vigorosamente.
3. Incubar la mezcla a 65ºC durante 2 horas.
4. Añadir 130µl del tamón AP2, mezclar bien e incubar 5 minutos en hielo.
5. Centrifugar durante 5 minutos a 13000 rpm.
6. Recoger el sobrenadante y pasarlo a un tubo-columna QIAshredder y centrifugar durante 2 minutos a velocidad máxima.
7. Transferir el líquido que se ha filtrado al tubo de abajo a un tubo eppendorf nuevo, sin arrastrar ningún resto de precipitado (si lo hay).
8. Añadir 1,5 volúmenes de tampón AP3/E y mezclar inmediatamente mediante pipeteo.
9. Recoger 650 µl de esa mezcla, incluyendo cualquier precipitado que pueda haberse formado, a la columna DNeasy mini spin. Centrifugar durante 1 minuto a velocidad mayor a 8000 rpm (10000 rpm) y desechar el líquido filtrado.
10. Repetir el paso anterior con la muestra restante. Desechar el filtrado y el tubo colector.
11. Colocar la columna DNeasy en un tubo nuevo de recogida, añadir 500 µl de tampón AW y centrifugar durante 1 minuto a 10000 rpm. Desechar el filtrado y reutilizar el tubo para el siguiente paso.
12. Añadir 500 µl de tampón AW a la columna DNeasy y centrifugar durante 2 minutos a 13000 rpm para secar bien la membrana.
13. Transferir la columna DNeasy a un microtubo de 1,5 o de 2 ml y añadirle 100 µl de tampón AE precalentado a 65 ºC directamente en la membrana DNeasy. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 minuto a 10000 rpm.
14. Repetir el paso anterior.
15. Guardar la muestra obtenida en congelación.