Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

• Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
• Bacillus (+) de Clostridium (-).
• Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:

1. Método del portaobjetos (recomendado):

• Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
• Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H₂O₂ al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
• Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
• Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2. Método del tubo de ensayo:

• Agregar 1ml de H₂O₂ al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado.
• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.